一种DNA四面体-槲皮素复合物及其预防脓毒症的用途

背景：

脓毒症作为全球最致命的综合征之一，已成为重症监护病房（ICU）患者的主要死因之一，其死亡率约为50%。据报道，脓毒症通常涉及感染的免疫反应失调，导致全身破坏性炎症和严重并发症，如多器官衰竭或多器官功能障碍综合征 (MODS)。尽管过去十年对脓毒症引起的免疫功能障碍的机制探索有所深入，但对于其大部分并发症，尤其是多器官衰竭仍难以对其提供满意的治疗。因此，迫切需要开发新颖的、有效的脓毒症治疗方法。

根据研究报道，脓毒症不受控制的严重炎症通常与革兰氏阴性 (G-) 细菌外膜的主要成分脂多糖 (LPS) 有关。具体而言，先天免疫系统是宿主抵御病原体入侵的主要防御机制。当机体受到病原微生物的严重感染时，被称为先天免疫系统前哨细胞的巨噬细胞参与炎症细胞因子风暴以消除病原体。

病原体表面的LPS被巨噬细胞的Tolly样受体识别并通过核因子κ-轻链增强子 (NF-κB) 家族和丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 等转录因子传递信号，以诱导负责促炎介质合成和释放的基因表达，包括趋化因子、活性氧 (ROS)、细胞因子，特别是白细胞介素 6 (IL-6)、肿瘤坏死因子 α (TNF-α) 和白细胞介素 1 (IL-1)。然后过度的先天性和适应性炎症和氧化成分导致系统性炎症风暴，进而导致细胞、组织甚至肺、肝、肾等多器官损伤。

因此，有效抑制过度的全身性炎症是治疗脓毒症的关键。

前沿科研成果： 

天然化合物已被用于预防和治疗各种炎症和免疫相关疾病，例如特应性皮炎、类风湿性关节炎和脓毒症。它们因其潜在的治疗效果、低成本、被人群广泛接受而引起了极大的关注。槲皮素(Que)是一种广泛存在于植物中的类黄酮化合物。它因其抗癌、抗炎、抗衰老和相对安全性（低毒性）等多效生物学特性而被广泛研究。

多项研究表明，槲皮素可以抑制免疫细胞的氧化应激和过度炎症反应，从而抑制LPS引起的全身炎症和包括肾脏、心脏、肺等在内的多器官功能障碍。其具体机制涉及槲皮素通过抑制LPS诱导的NF-κB激活和核转位、细胞外信号调节激酶1/2 (Erk1/2) 和c-Jun N-末端激酶的磷酸化，从而降低炎症细胞因子TNF-α、IL-1和IL-6 的水平。此外，槲皮素通过抑制NOX2和促进Nrf2产生来减少LPS诱导的ROS。

遗憾的是，由于槲皮素水溶性差、生物利用度低和在生理介质中的不稳定性，其应用受到严重限制。因此，有必要开发新型纳米材料来改善槲皮素的递送，以提高槲皮素的功效。

四面体框架核酸（tetrahedral framework nucleic acid, tFNA）又称DNA四面体（tetrahedral DNA，TDN）、四面体DNA纳米结构，它由4条单链DNA通过链间碱基互补配对形成，形态类似四面体。这种纳米结构合成效率高，合成步骤简单，具有良好的生物安全性和生物相容性。DNA四面体框架核酸已是一种研究较为深入的纳米材料，结构具有许多优点，包括可忽略的免疫原性，天然生物相容性，结构稳定性和无与伦比的可编程性，这是有效药物载体的先决条件。同时研究表明DNA四面体具有一定的生物活性，如具有抗炎作用等。因此DNA四面体有望成为一种重要的药物载体。

但是由于DNA四面体的结构特殊，且具有一定活性，因此DNA四面体负载小分子药物后两者相互作用如何，是发挥协同作用还是拮抗作用，这是未知的，不同小分子药物效果可能会出现较大的不同。目前尚未见DNA四面体载槲皮素，DNA四面体能否成功负载槲皮素，使其发挥更好的效果需要进一步研究。

研究方法： 

采用AFM、TEM、和PAGE等方法鉴定tFNA-Que的合成；共聚焦显微镜和流式细胞术检测tFNA-Que进入巨噬细胞的能力；CCK8检测tFNA-Que的生物相容性；NO检测试剂盒验证巨噬细胞对NO产生的抑制作用；流式细胞术及共聚焦显微镜检测tFNA-Que对巨噬细胞ROS产生情况的影响；qPCR、WB检测tFNA-Qu对巨噬细胞抗炎、抗氧化相关基因和蛋白的调控。小动物活体成像检测tFNA-Que在小鼠体内的稳定性及代谢情况，动物实验（LPS全身炎症模型）检测tFNA-Que对LPS诱导的体内全身炎症和多器官损伤的保护作用。

实验结果： 

本技术团队成功构建了一种DNA四面体-槲皮素（tFNA-Que）复合物，其中槲皮素通过嵌入结合模式与tFNA相互结合。TFNA-Que具有合成方法简单、性能稳定、生物相容性良好、水溶性佳、抗炎、抗氧化性能优越等优点。我们采用LPS刺激巨噬细胞作为体外模型，LPS腹腔注射小鼠作为体内模型，经过体内体外实验的验证，证实了tFNA-Que可通过调节ERK/NF-κB通路增强Que和tFNA的抗炎作用，同时tFNA-Que通过调节Nrf2/HO-1通路提高Que和tFNA的抗氧化能力。 在体内tFNA-Que 通过调节巨噬细胞显著减少全身炎症并保护包括肺、肝和肾在内的多个器官免受炎症风暴的损伤。简而言之，tFNA-Que的合成提供了一种简单有效的协同递送纳米系统，它可能是发挥抗炎抗氧化作用颇具潜力的药物候选者。

研究结论：

本技术团队首次构建了一种DNA四面体-槲皮素（tFNA-Que）复合物，其中槲皮素通过嵌入结合模式与tFNA相互结合。tFNA-Que复合物提高了Que的稳定性和释放能力，并保持出色的进入细胞的能力。tFNA-Que复合物通过ERK / NF-κB途径调节的，从而在LPS抑制炎症方面发挥作用。tFNA-Que复合物在体外通调节Nrf2/HO-1途径降低LPS诱导的ROS。tFNA-Que复合物治疗对LPS诱导的体内全身炎症和多器官损伤的保护作用，为脓毒症的免疫预防提供新策略，并开辟了DNA纳米结构协同递送的新思路。

发表文献：Adv. Funct. Mater. 2022, 32, 2204587.，IF=19  DOI: 10.1002/adfm.202204587

Suppression of Lipopolysaccharide-Induced Sepsis by Tetrahedral Framework Nucleic Acid Loaded with Quercetin